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细胞转染基础知识

实验室资讯网时间:2018-11-29 点击: 百度搜索

【导读】转染基础知识 本章提供了转染概述,包括各种转染技术的一般信息以及根据您的细胞系和实验需要 选择适当的转染方法。有关细胞DNA和RNA转染的指导原则、转染实验成功的考虑因 素和实验流程,请参见转染方法章节(第30页起)。 转染介绍 什么是转染? 从广义上讲,转染是采用除病毒感染外的其他方法将......
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细胞转染基础知识

转染基础知识

本章提供了转染概述,包括各种转染技术的一般信息以及根据您的细胞系和实验需要 选择适当的转染方法。有关细胞DNA和RNA转染的指导原则、转染实验成功的考虑因 素和实验流程,请参见转染方法章节(第30页起)。

转染介绍

什么是转染?

从广义上讲,转染是采用除病毒感染外的其他方法将核酸(DNA或RNA)人工导入细胞 的过程。采用各种化学、生物学或物理方法导入外源性核酸会改变细胞的特性,从而 实现细胞基因功能和蛋白质表达研究。

转染后,导入的核酸可以瞬时性地存在于细胞内,只表达一段时间且不会复制,也 可以稳定地整合至受体基因组内,随着宿主基因组的复制而复制(参见第4页的转染类 型)。

术语

各种基因输送系统采用的术语与该领域的技术进展步调一致,并进一步区分不同的方 法和细胞类型。

转染

转染通常是指将核酸输送到真核细胞,或者更明确地说是输送到动物细胞内。术语转 染一般用来表示原核生物感染病毒或噬菌体中病毒核酸的摄取,导致成熟病毒颗粒的 感染和生成。但该术语现在的含义包括将外源性核酸人工导入细胞内。

转化

转化通常用来描述细菌、非动物真核细胞和植物细胞中非病毒DNA的转移。但是,转 化还表示引起动物细胞表型发生永久性改变的特定事件或一系列事件,暗示遗传不稳 定性及发展为癌症状态。尽管从这个意义上讲,转化可以源于转化病毒的感染或基因 转染,也可以同时发生或在外来刺激物(如离子辐射或化学致突变源)刺激下产生。因 此,在描述外源性遗传物质导入时,应避免将该术语用于动物细胞。

转导

转导用于描述病毒介导的DNA转移。但是,术语转染也可以表示细胞的病毒核酸(从真 核细胞病毒或噬菌体中分离)感染。

应用

转染的两个主要目的是生成重组蛋白,或特异性地提升或抑制转染细胞中的基因表 达。因此,转染是一种功能强大的分析工具,可用于基因或基因产物的功能和调控研 究,用于生成转基因生物,并用作基因治疗方法。

基因表达

转染最常通过使用质粒载体或mRNA在培养细胞(或动物模型)中表达目的蛋白。利用真 核细胞中的蛋白表达可以生成经过适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白。另外,将带有 可检测的标记物及其他修饰的蛋白质导入细胞,可用于启动子和增强子序列或蛋白: 蛋 白相互作用的研究。

此外,根据转染策略的不同,转染还可应用于各种形式的生物生产。例如,导入重编 程转录因子可以生成诱导多能性干细胞(iPSC)。另一方面,稳定转染提供了不同治疗 分子的生物生产方法。

基因抑制

转染的另一个常用用途是通过RNA干扰(RNAi)抑制特定蛋白质的表达。在哺乳动物细胞 中,利用内源性表达的非编码RNA,以microRNA (miRNA)的形式-来源于双链RNA (dsRNA)前体-完成RNAi。前体被加工成成熟miRNA,成为RNA诱导的沉默复合物 (RISC)的一部分,抑制互补靶mRNA的翻译。

载体系统表达miRNA前体或短发夹RNA (shRNA)前体,它们通过内源性机制分别生成 miRNA或shRNA,然后抑制基因表达。利用这些系统可以实现重组体的稳定转染,并 允许前体分子的诱导型表达。

化学合成的短/小分子干扰RNA (siRNA)还可以整合形成RISC,通过靶向互补mRNA (降 解)诱导基因沉默。siRNA修饰有助于防止脱靶效应,还可以确保dsRNA的活性链整合 至RISC中。

转染类型 瞬时转染

将核酸导入细胞的生物、化学和物理方法有很多种。并非所有方法均适用于所有的细 胞类型和实验应用,不同方法的转染效率、细胞毒性、对正常生理学的影响和基因表 达水平各异。但是,所有转染策略均可分为两大类,其中一些导入核酸在细胞中存在 一段时间(瞬时转染),而另一些则长时间存在于细胞中,并被传递至转染细胞的子代 (稳定转染)。

在瞬时转染中,导入核酸只在细胞中存在一段时间,且未整合至基因组。因此,在细 胞分裂过程中,瞬时转染的遗传物质不会传递至下一代,其会在环境因素影响下丢失 或在细胞分裂过程中被冲淡。但高拷贝数的转染遗传物质会引起蛋白质的高水平表达 (在其存在于细胞期间)。

根据使用的重组体的不同,瞬时表达的转基因可以在1至7天内检出,但瞬时转染的细 胞一般在转染后24至96小时收获。基因产物分析需要提取RNA或蛋白质进行酶活性 分析或免疫分析。最佳时间间隔取决于细胞类型、研究目标和导入基因特定的表达特 性,以及报告基因达到稳态所需的时间。但在数天内,大部分外源性DNA会在核酸酶 作用下降解或被细胞分裂冲淡;一周后便无法再测出。

使用超螺旋质粒DNA进行瞬时转染的效率最高,因为它能被细胞更高效地摄 取。siRNA、miRNA、mRNA甚至蛋白质也可用于瞬时转染,但与使用质粒DNA一 样,这些大分子需要达到高质量和相对高纯度(参见第30页的影响转染效率的因素)。 在转染DNA进入细胞核转录的同时,转染RNA仍保留在胞浆内,它可在转染(mRNA) 几分钟内表达或者与mRNA结合,使靶基因表达沉默(siRNA和miRNA)(参见第51页的 RNA转染指导原则)。

稳定转染

在稳定转染中,外源性DNA被整合至细胞基因组中,或者作为附着体质粒存在。与瞬 时转染不同,稳定转染可以使外源性DNA长期存在于转染细胞及其子代细胞中。因 此,稳定转染可以使导入基因在多代细胞中永久性地表达,适用于重组蛋白生产和外 源性DNA表达的下游或长期效应分析。但是,通常只有单个或几个拷贝的外源性DNA 被整合至稳定转染细胞的基因组中。正因如此,稳定转染基因的表达水平一般低于瞬 时转染基因的表达水平。

由于将外源性DNA稳定整合至基因组中的概率相对较低,因此成功完成稳定转染需要 高效DNA导入和筛选含有DNA的细胞的方法。筛选稳定表达转染DNA的细胞的最可靠 方法之一是在用于转染的DNA重组体中加入选择标记物,然后经过短暂的恢复期后, 在细胞中应用适当的选择压力(参见第23页的稳定转染子的选择)。

常用的选择标记物是可传递对各种筛选药物抗性的基因或可以补偿转染细胞系中缺陷 必需基因的基因。使用选择性培养基培养时,未转染的细胞或瞬时转染细胞最终都会 死亡,而表达一定水平的抗生素抗性基因或可以补偿必需基因缺陷的细胞则可以存活。

在某些情况下,还可以将转染细胞中的表型或形态学变化用作可筛选的特性。例如,采 用源于牛乳头瘤病毒的载体转染小鼠CI127细胞,可出现形态学变化(Sarver et al .1981)。 尽管相比超螺旋DNA,细胞对线性DNA的摄取量较低,但它可以将DNA最佳整合至宿 主基因组中(参见第30页的影响转染效率的因素)。一般而言,稳定转染仅限于DNA载 体,但使用选择性DNA载体制备短发夹转录本,亦可将siRNA和miRNA稳定导入细胞 内(参见第50页的载体介导的RNAi)。但是,RNA分子本身无法用于稳定转染。

选择转染策略

决定您需要瞬时转染还是稳定转染的因素是您所进行实验的时间范围和最终目标。瞬 时转染细胞一般在转染后24–96小时收集,常用于研究基因或基因产物的短期表达效 应,执行RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默,或者快速生成小量重组蛋白。mRNA瞬时 转染可以更快速地提供结果;因为mRNA在胞浆中表达,无需转移到细胞核,无需转 录,转染数分钟后即可在部分系统中表达转染mRNA。

相比之下,当需要长期基因表达或转染细胞需要在多个实验中使用时,则更多地选择 稳定转染。由于将DNA载体整合至染色体中的概率较低,因此细胞的稳定转染更麻 烦、更具挑战性,需要选择性筛选和克隆分离。因此,稳定转染通常用于大规模的蛋 白质生产、长期药理学研究、基因治疗或长期基因调控机制研究。

随着转染试剂的问世,尽管哺乳动物细胞的瞬时转染已可用于经过适当折叠和翻译后 修饰(当表达细菌细胞重组蛋白时则不适用)的重组蛋白的生产,表达毫克至克级重组蛋 白则主要依赖于建立稳定的细胞系。最近,采用悬浮培养的HEK293和CHO细胞进行大 规模的瞬时转染,可以获得大量重组蛋白,且无需经过麻烦的稳定细胞系建立过程。 研究人员使用目的载体和悬浮培养的CHO或HEK293细胞,利用瞬时转染进行重组蛋白 表达,可在3至7天内生成毫克/升级正确折叠和糖基化的重组蛋白。

Expi293™表达系统是瞬时表达技术的一次巨大进步,可在哺乳动物细胞中实现快速且 超高产量的蛋白生产。Expi293™表达系统采用Expi293™表达培养基对Expi293F™细胞 进行高密度培养,使用基于阳离子脂质体的ExpiFectamine™ 293转染试剂,结合优化 转染增强剂进行转染。所有组分协同作用,生成的蛋白产量较传统培养系统(如FreeStyle™ 293表达系统)高2至10倍,IgG和非IgG蛋白的表达水平可达>1g/L。如需了解有 关Expi293™表达系统的更多信息,请登录www.lifetechnologies.com/expi293。

临床生物治疗药物通常使用稳定的高表达转染子生产,因为它们可以在极大规模的生产 中实现批次间一致性和低成本。但在许多药物开发应用中,采用瞬时转染方法快速筛选 蛋白重组体具有一定的优势,可以在不到一周内同时评估不同的候选分子。在许多情况 下,可以在进行瞬时转染的同时建立稳定细胞系(更费时费力,需要三个月以上)。

细胞转染基础知识

细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌蛋白组成的,带有净负电荷。因此,它是大分子无法 通过的障碍,如同样带有负电荷的DNA和RNA的磷酸骨架。为了让核酸通过细胞膜, 研究人员开发出了各种技术,利用不同的方法-从使用化学物质和包被核酸的载体 分子进行中和到使用物理方法在细胞膜上开孔,将DNA直接运输到细胞内。

目前可用的转染技术主要分为三大类:化学方法,使用载体分子中和或将阳性电荷传 递至带负电的核酸上;生物学方法,采用已经过遗传学改造的病毒转移非病毒基因至 细胞内(又称为转导);及物理方法,将核酸直接导入细胞质或细胞核内。但是,没有一 种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须根据您的细胞类型和实验要求选择理想 的方法,必须具有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最小,且使用简 单、可重复(Kim and Eberwine, 2010)。

细胞转染基础知识
细胞转染基础知识

本文节选自:《转染基础知识手册》 创新成就未来

(本文来源:http://www.labtoday.net/plus/view.php?aid=5677 )

(责任编辑:大林)

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